Pengumpulan Sampel Air Laut

Sampel dianggap sebagai perwakilan dari populasi yang hasilnya mewakili keseluruhan gejala yang diamati. Pada jurnal Skrining dan Identifikasi Bakteri dari Air Laut, sampel air laut diambil dari Pantai Pondok Bali, Subang, Jawa Barat. Sebanyak 1 mL air laut disuspensikan ke dalam medium Nutrient Broth (NB). Nutrient Broth (NB) merupakan media untuk pertumbuhan mikroorganisme yang berbentuk cair dengan bahan dasar adalah ekstrak beef dan peptone. Kemudian suspensi tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Sampel air laut yang disuspensikan diambil dari 3 tempat yang berbeda dihitung dari garis pantai, yaitu 300 m, 600 m, dan 900 m

Isolasi Bakteri

Pertama dilakukan penyiapan media uji, yaitu media Nutrient Agar (NA) dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan membeku. Nutrient  Agar (NA) merupakan suatu medium yang berbentuk padat, yang merupakan perpaduan antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia. NA dibuat dari campuran ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan agar sebagai pemadat.

Isolasi bakteri dilakukan menggunakan metode cawan gores. Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum (kultur mikrobia yang diinokulasikan kedalam medium pada saat kultur mikrobia tersebut pada fase pertumbuhan) digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah. Satu ose suspensi bakteri digoreskan pada media uji dan diinkubasikan pada suhu 37° C selama 18-24 jam.

Kemudian Isolat bakteri dari berbagai koloni yang tumbuh digoreskan pada media uji untuk membuat master plate (kultur awal) koloni bakteri dan diinkubasikan pada suhu 37° C selama 18-24 jam.

 

Identifikasi Bakteri Penghasil Enzim Kitinase

Setelah melakukan inkubasi maka dilakukanlah pengamatan morfologi koloni yang meliputi bentuk dan warna koloni menggunakan mikroskop. Kemudian dilakukan pewarnaan gram. Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengidentifikasi menjadi gram positif atau gram negatif, yaitu yang dibedakan berdasarkan fisik, dimana gram positif akan bewarna ungu dan gram negatif bewarna merah. Perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda.  Bakteri gram positif seperti Staphylococcus aureus (bakteri patogen yang umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90% dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikhoat. Di sisi lain, bakteri gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran pasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya. Pengamatan ini dilakukan di bawah mikroskop.

Berikutnya melakukan uji biokimia, yaitu dengan menguji adanya proses kimia yang berlangsung dalam mikroba tersebut, diantaranya

  • Uji Fermentasi Karbohidrat

Koloni tersebut diinokulasikan ke dalam tabung-tabung yang masing-masing berisi glukosa, laktosa, manosa, maltosa, dan sukrosa. Kedalam masing-masing larutan gula tersebut ditambahkan indikator phenol red (fenol merah) dan dimasukan tabung durham dengan posisi terbalik. Suspensi mikroba tersebut diinkubasikan pada suhu 37° C selama 18-24 jam. Bila warna medium berubah menjadi kuning, artinya koloni tersebut membentuk asam dari fermentasi karbohidrat. Bila pada tabung durham terdapat gelembung udara, artinya dari fermentasi tersebut terbentuk gas. Hasil pada penelitian ini adalah positif, dengan demikian dapat disimpulkan bahwa koloni bakteri putih mampu memfermentasikan karbohidrat dengan substrat glukosa, manitol, laktosa, maltosa, dan sukrosa.

  • Uji Motil Indol Urea (MIU)

Koloni yang akan diidentifikasi diambil menggunakan ose. Koloni diinokulasi pada satu media uji motil indol urea yang berupa agar semi solid dengan cara ditusuk. Media diinkubasikan pada suhu kamar selama 18-24 jam. Pergerakan bakteri ditunjukan dengan adanya penyebaran koloni di sekitar tusukan. Reaksi urea positif ditunjukkan perubahan warna media menjadi merah muda. Reaksi indol positif ditunjukkan dengan penambahan pereaksi kovac yang kemudian akan menghasilkan cincin merah di atas permukaan, dan menunjukan negatif jika menghasilkan cincin jingga di atas permukaan. Pada penelitian ini, uji motil menunjukkan hasil positif hal ini dapat dilihat dengan mengamati penyebaran pertumbuhan bakteri tidak hanya disekitar tusukan. Hal ini menunjukkan koloni bakteri tersebut memiliki alat gerak. Sedangkan uji indol menunjukkan hasil negatif., dengan demikian bakteri tersebut tidak mampu menguraikan Triptofan.

  • Uji Sitrat

Koloni ditanamkan secara gores zig-zag pada media perbenihan simmons citrate yang berupa agar miring. Kemudian media diinkubasikan pada suhu 37° C selama 18-24 jam. Koloni berwarna biru menunjukkan hasil positif sedangkan koloni berwarna hijau menunjukkan reaksi negatif. Uji sitrat dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri tersebut menggunakan sitrat sebagai sumber energi apabila tidak ada glukosa atau laktosa. Dalam penelitian ini menunjukan hasil negatif, dengan demikian bakteri tersebut tidak menggunakan sitrat sebagai sumber karbon.

  • Uji Metil Red (MR)

Koloni diinokulasi pada media MR-VP. Media diinkubasikan pada suhu 37° C selama 18-24 jam. Kemudian ditambahkan tiga sampai empat tetes indikator merah metil. Warna merah menunjukkan reaksi positif. Uji metil red dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri mixed acid fermenter (peragian asam campuran). Pada uji metil red memberikan hasil yang negatif, oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut tidak menghasilkan asam melainkan 2,3-butanadiol dan etanol

  • Uji Voges – Proskauer (VP)

Koloni diinokulasi pada media MR-VP. Media diinkubasikan pada suhu 37° C selama 18-24 jam. Kemudian ditambahkan reagen Barrit. Suspensi tersebut dikocok selama 20-30 detik. Reaksi VP positif, bila terjadi pembentukan asam yang ditandai berubahnya warna medium menjadi merah muda setelah penambahan pereaksi Barrit. Uji ini dilakukan untuk mendeteksi keberadaan senyawa 2,3-butanadiol. Pengujian yang dilakukan memberikan hasil negatif.

PRODUKSI KITINASE

Kitinase merupakan enzim golongan hidrolitik yang dapat menghidrolisis kitin dari berbagai sumber. Kitinase dan hasil hidrolisisnya banyak dimanfaatkan dalam bidang bioteknologi pertanian, kesehatan dan lingkungan (Muzzarelli and Peter, 1997; Patil et. al., 2000). Berdasarkan penelitian Hasnah et al. (2012) Produksi kitinase dapat dilakukan dengan menggunakan inokulum aktif 10-15% dari spora biakan B. licheniformis HSA3-1a dengan komposisi medium: (NH4)2SO4 0,7%, yeast ekstrak 0.05%, bakto tripton 0,1%, NaCl 0,1%, K2HPO4 0,1%, MgSO4.7H2O 0,01% dan koloidal kitin 0,5%, dishaker pada 55°C, 180 rpm selama 72 jam.

Enzim kitinase dari B. licheniformis HSA3-1a diproduksi maksimum selama 72 jam dalam medium sintetik minimum (MSM) dengan kondisi suhu 50°C dan pH 7,0 yang seiring dengan pertumbuhan sel mencapai akhir fase stasioner dengan aktivitas kitinase sebesar 0,225 U/mL. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut membutuhkan enzim kitinase sebagai strategi dalam mempertahankan hidupnya. Hasil tersebut sesuai dengan penelitian Toharisman et al. (2005) yang memproduksi kitinase dari B. licheniformis MB-2 maksimum pada jam ke-72 pada kondisi suhu 55°C, pH 7,0. Serta kitinase dari Bacillus MH-1 diproduksi maksimum pada suhu 58°C dalam kisaran waktu 72–96 jam (Sakai et al., 1998).